对生猪养殖业而言，非洲猪瘟是当前最具危险性的传染疾病之一自2018年冬季传入我国以来以对我国生猪养殖业带来了巨大损失。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种高度接触性，致死率极高的烈性传染病。由于非洲猪瘟临床症状与猪瘟（CSF）和猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）等病症极其相似，所以仅通过临床症状无法区分，因此需要使用分子生物学手段对非洲猪瘟病毒进行检测，以做到对非洲猪瘟病毒及时、快速、准确的诊断，以确保将非洲猪瘟的威胁性降到最低。笔者将简述目前常见的非洲猪瘟病毒检测方法及注意事项，以期为生猪养殖从业人员在非洲猪瘟病毒检测及非瘟防控提供参考。

1 非洲猪瘟病毒检测方法

1.1 病原学检测

ASFV的病原学检测，主要有聚合酶链式反应（PCR）、微滴数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）、线性指数PCR、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、原位杂交技术（ISH）、环介导恒温扩增技术（LAMP）、探针杂交技术等。

PCR检测：PCR是疫病最早期采用的检测方法，非洲猪瘟病毒的PCR检测是根据其基因中的高度保守区序列，设计特异性引物进行扩增，检测和鉴定属于所有已知病毒基因型的广泛分离株。依据世界动物卫生组织推荐的的PCR检测方法，可以扩增出22株不同的ASFV病毒，但传统PCR方法由于耗时较长且对设备要求高，因此并未广泛应用于养殖一线。

巢式PCR：采用内外两对PCR引物，可以在检测组织、血液样品和培养物的基础上，检测昆虫体内所带的ASFV。巢式PCR克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；并且因为模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；由于内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因引此可以保证整个反应的准确性及可行性。

荧光定量PCR：荧光定量PCR是在常规PCR基础上对某些特定基因如p72、p54、K205R等设计引物和探针，使得检测特异性和敏感性得到了较大的提升。非洲猪瘟传入中国以来，由于部分猪场已经出现CSFV、ASFV以及PRRSV混合感染的情况。因此，利用多重PCR技术不但可对混合感染的猪只做及时和准确的诊断，而且还能极大程度减少检测耗材的使用，缩短检测时间。

微滴数字PCR检测：ddPCR比普通荧光定量具有更高的敏感性和特异性，其采用终点稀释方法实现了最小剂量单分子病毒的扩增，进而计算出样品的起始浓度，最终达到对病毒含量的绝对定量。但由于微滴数字PCR需要使用较为昂贵的仪器设备和试剂，因此很难用于大规模样品的检测。

环介导等温扩增技术：是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增技术，可做到快速检测非洲猪瘟病毒，通常30分钟即可完成检测。与常规PCR相比，环介导等温扩增不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，因此对仪器设备的要求较低，便于在养殖场、屠宰场、饲料厂进行快速检测，该检测方法也是目前生产一线最常用的非洲猪瘟病毒检测方法之一。

重组聚合酶扩增技术：重组聚合酶扩增技术是一种新兴的分子学检测方法，目前也被应用于ASFV的检测中，其原理类似于体内的DNA的复制过程，通过生成重组酶-DNA复合物来启动DNA的合成，进而进行目标区域的指数式扩增。由于RPA的反应温度介于37-42℃之间，舍去了常规实时荧光定量技术中加热到退火的过程，所以其反应时间可以缩短至20分钟左右。该方法在保证了扩增敏感性和特异性的同时，又极大的缩短了检测时间。

下图为实时荧光定量技术检测非洲猪瘟病毒的基本原理（图1）。

 

图 1实时荧光定量技术原理

1.2 血清学检测

利用抗原抗体反应进行的抗原检测和抗体检测，是血清学检测的两种重要手段。针对ASFV抗原的检测方法主要有荧光抗体试验、双抗夹心酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析法等；针对ASFV抗体的检测方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光试验、胶体金免疫层析技术等。

血清学抗原检测：目前世界动物卫生组织推荐的用于抗原鉴定的方法为荧光抗体试验，主要用于鉴定不产生红细胞吸附试验反应的非洲猪瘟病毒毒株，通过荧光标记单抗而检测动物组织内的抗原；在ELISA基础上发展起来的双抗夹心ELISA方法，运用抗原抗体特异性结合原理，先将特异性抗体与固相载体结合，在此基础上加入待检抗原，然后加入酶标抗体，使得一单位的抗原同时结合两个单位的抗体从而形成所谓的“双抗体夹心”，最后加入底物试剂与酶标抗体结合，根据显色深浅来判断抗原含量。此外，ASFV的交叉引物扩增结合免疫层析快速检测方法，不仅方便快捷，且有着良好的敏感性。免疫胶体金技术是一种常用的标记技术，而胶体金免疫层析法则是运用类似于侧向流动免疫色谱分析的虹吸原理，来检测样品中抗原的有无，适合快速检测和流行病学调查。

血清学抗体检测：抗体检测是血清学检测中最常规的方法，目前针对p72、p30、p54、K205R等ASFV蛋白，国内外都已建立了间接ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA等多种方法。目前市场上已有很多商品化ELISA试剂盒，特异性与灵敏度都非常高，是人们进行ASFV检测时的首选方法。同时，免疫胶体金技术针对包被分子的不同也可以用来检测ASFV抗体，该两种方法均是生产一线中快速诊断非洲猪瘟的方法之一。

2 非洲猪瘟病毒检测注意事项

非洲猪瘟病毒检测涉及样本采集、样本保存、样本运输、样本处理与最终检测等多个环节，一个环节出现纰漏，就极易出现假阳性或者假阴性的错误检测结果。提高检测可靠性，避免出现假阳性或者假阴性结果，我们需要做到以下几点。

2.1 样品端

规范样本采集操作。随机采样时要注意仔细观察猪的精神状态，对精神状态不好伴有发烧症状的猪只要重点采集确保不漏任何一头；或者随机采样时，对全群猪只进行间隔采集，保证不漏采任何一头疑似猪只。当采集的样品为组织样时，应将样品50%中性甘油溶液或含I00 μg/mL青霉素和链霉素的PBS溶液中，样品采集完成后要置于低温环境中保存和运输（12h内可4℃环境中运输），到达实验室至检测前应将样品置于－20℃中保存，以保证检测结果的准确性。

2.2 试剂端

规范化检测试剂的保存。很大一部分假阳性与假阴性的检测结果，是由于检测试剂保存不当造成的。因此我们要规范化检测试剂的管理，做好试剂的生产日期及失效日期登记，并将试剂保存在适宜的环境中。

2.3 病毒检测端

病毒检测过程中若存在不符合操作规程的地方也会导致检测结果出错。核酸检测是微量操作，要求极为严格。首先，要做好检测人员的专业知识和实操技能的培训，保证检测人员在样品处理端和加样端的操作符合规程。另外样品RNA提取和逆转录的过程对操作人员的加样速度、超纯水以及洁净度要求较高，如果环境中存在RNA酶则会使RNA降解从而导致检测结果出错。因此，在病毒检测端在保证操作环境洁净的同时一定要确保检测人员有着较高的实验室素养和实操水平。

3 总结

虽然分子生物学检测非洲猪瘟病毒是诊断非洲猪瘟疾病最有效的、最便捷、最准确的方法，但是要确保检测结果的真实可靠就一定要将病毒检测过程中每一个操作步骤都执行到位，准确可靠的结果能有效防止非洲猪瘟的进一步扩散，降低非洲猪瘟对生猪养殖业的威胁。